IMOBILITAS ENZIM

PENGERTIAN :

Imobilisasi enzim adalah proses menggabungkan suatu enzim dengan suatu matriks padat (support) secara fisik, sehingga dapat digunakan secara berulang kali dan secara kontinyu. Teknik ini dikembangkan untuk memperbaiki beberapa kekurangan penggunaan enzim tersebut.

Teknik Imobilisasi Enzim (Chibata, 1978)  : merupakan Enzim yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu daerah/ruang tertentu, sehingga dapat menahan aktivitas katalitiknya serta dapat digunakan secara berulang-ulang dan kontinyu.

Metode imobilisasi enzim

Bentuk enzim imobil : Partikel, membran, selongsong atau serat

Keterangan metode imobilisasi enzim :

1.     “Carrier Binding : Enzim yang  diikat pada “carrier” (matriks) yang tidak larut air.dibagi menjadi 3 jenis yaitu :1.) Adsorbsi fisik, mudah dilakukan dan ekonomis, Enzim diadsorbsi pada permukaan “carrier”. Kelebihan :  Kondisi lunak → aktivitas enzim tetap tingg, Dapat diregenerasi.  Kelemahan : Kekuatan ikatan lemah ⇒ pH atau kekuatan ion berubah mengakibatkan terjadinya bocor, Enzim dirusak oleh m.o/enzim proteolitik. 

                     2.) Ikatan Ionik, terjadi ikatan ionik antara enzim dengan “carrier” yang tidak larut air dan mengandung residu penukar ion (R).  Kelebihan dan kekurangan sama dengan cara adsorbsi.

                     3.)  Ikatan Kovalen,  terbentuk ikatan kovalen antara enzim dengan “carrier” tidak larut dalam air ⇒ ikatan kuat & tdk bocor

2.     Cross Linking (Ikatan Silang) : Terjadi ikatan kimia, tetapi tidak digunakan carrier tidak larut air ⇒ Pembentukan ikatan melintang inter molekuler antara moleklul enzim dengan pereaksi bifungsional atau multifungsional.

3.     Entrapping (penjeratan) : Lokalisasi enzim dalam kisi matriks atau mikrokapsul (membran semipermeabel) ⇒ Enzim tidak terikat pada matriks gel atau membran.  

ü  Tipe kisi (lattice type)

Metode penjeratan tipe kisi meliputi penjeratan enzim dalam bidang batas (interstitial space) dari suatu ikat – silang polimer yang tidak larut dalam air misalnya gel matriks.

ü  Mikrokapsul

Penjeratan dengan cara mikrokapsul melibatkan pelapisan enzim dengan membrane polimer semipermeable. Prosedur untuk mikro enkapsulasi enzim dapat dibagi ke dalam tiga kategori, yaitu:

-Polimerisasi interfasial

-Pengeringan cair (liquid drying)

-Pemisahan fase (phase separation)

Keuntungan Imobilisasi

Menurut Messing,1975 disitasi oleh Smith, 1990  yaitu:

1.     Dapat digunakan berulang

2.     Penghentian proses cepat  (diambil dengan filtrasi, laju alir <<)

3.     Kestabilan lebih baik dengan adanya ikatan dengan adanya ikatan pada imobilisasi.

4.   Hasil tidak terkontaminasi enzim Îuntuk pangan dan farmasi

5.  Dapat digunakan untuk tujuan analisis, misalnya menentukan umur tengah enzim dan

     perkiraan penurunan aktivitas

6.  Dapat digunakan untuk proses kontinyu

7.  Pengontrolan lebih baik

PEMURNIAN ENZIM

Tujuan pemurnian enzim adalah untuk mengidentifikasi fungsi dan struktur protein.

Beberapa teknik pemurnian enzim

·       Sentrifugasi

Metode ini dipilih untuk memisahkan larutan dari molekul yang lebih besar dalam skala laboratorium. Sentrifugasi jarang digunakan dalam skala besar atau industry karena kapastitasnya yang kecil dan dibutuhkan kecepatan yang sangat tinggi. Diameter partikel yang besar, perbedaan massa jenis partikel dan larutan besar, serta viskositas larutan yang rendah akan mempermudah terjadinya pemisahan. Kecepatan sudut yang tinggi, radius putaran yang besar, dan lapisan cairan yang tipis dapat mempercepat proses.

·       Filtrasi

Filtrasi merupakan pemisahan padatan dari sejumlah larutan melalui sebuah penyaring sehingga partikel padat akan tertahan di penyaring tadi. Kecepatan aliran cairan yang melewati penyaring bergantung pada perbedaan tekanan, hambatan oleh materi, kekentalan cairan, dan hambatan oleh lapisan yang sudah terbentuk. Hal ini menyebabkan keefektifan penyaringan yang mula-mula tinggi menurun drastic dengan semakin banyaknya materi yang tersaring. Penyaring yang biasa dipakai merupakan filter press dan rotary drum filter.

·       Flokulasi dan koagulasi

Teknik ini baik digunakan sebelum sentrifugasi atau filtrasi. Pada cairan yang sangat encer, flokulasi terjadi dengan penambahan suatu reagen. Koagulasi merupakan adhesi spontan antar partikel bila muatan partikel yang satu dapat dinetralkan oleh muatan partikel lain. Teknik ini dapat diterapkan untuk pengendapan seluruh pecahan sel, atau larutan protein.

·       Ultra filtrasi dan Osmosa Balik

Pada ultrafiltrasi, molekul-molekul dipaksa melewati suatu membrane dengan ukuran pori sangat kecil dengan menggunakan tekanan hidraulik. Pada osmosa balik ukuran pori sedemikian kecilnya sehingga yang dapat menembus melalui membrane hanya molekul-molekul pelarut. Osmosa balik sering dipakai untuk pemekatan enzim sedangkan ultrafiltrasi digunakan untuk fraksionasi protein berdasarkan ukurannya.

·       Kromatografi

Kromatografi merupakan cara pemisahan berdasarkan perbedaan interaksi antara komponen-komponen yang akan dipisahkan dengan fasa diam dan fasa gerak.

ü  Kromatografi gel filtrasi

Prinsip dari teknik filtrasi gel (kromatografi filtrasi gel) adalah pemisahan molekul berdasarkan perbedaan ukurannya. Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100.

ü  Kromatografi penukar ion

Dalam kromatografi kolom penukar ion terdapat dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Syarat-syarat bahan yang bisa digunakan untuk fasa diam adalah tidak terlarutpada fasa gerak, stabil pada kondisi proses yang dikehendaki dan mampu menyerap zat-zat yang dipisahkan. Sedangkan bahan yang bisa dipakai sebagai fasa gerak harusmempunyai sifat - sifat tidak melarutkan fasa diam, stabil terhadap kondisi proses danmampu melepaskan atau melarutkan unsur - unsur atau ion - ion yang terserap/terikatpada fasa diamnya, dengan besar kelarutan yang berbeda - beda. Bahan yang dipakai untuk fasa diam adalah resin penukar ion. Resin penukar ion ini dapat menyerap ion – ion yang dipisahkan, dengan menukarkan ion - ion yang sesuai antara ion fasa diamnyadengan ion pada fasa geraknya. Dalam proses pertukaran ion, fasa gerak bertugasmengambil kembali ion-ion yang terkait pada penukar ion dengan jalan mengalirkannyamelalui tumpukan penukar ion. Pada umumnya proses ini berlangsung pada sebuahkolom, dan fasa gerak ini dialirkan dari atas ke bawah dengan kecepatan tertentu,sehingga mampu menyebabkan reaksi pertukaran ion ketika fasa gerak mengalir melaluitumpukan resin penukar ion

ü  Kromatografi afinitas

Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat popular dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibody terhadap antigennya, atau afinitas hormone terhadap reseptornya. Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik. Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap.

Pertimbangan Penggunaan Enzim Imobil untuk Industri :

1.   ™ Biaya pembuatan enzim imobil “carrier” sering mahal & sulit diperoleh ™

2.  Aktivitas enzim imobil mengalami penuruanan aktivitas dpt menyebabkan konversi rendah

3.  Kestabilan enzim imobil penting untuk menjaga keseragaman produk & tingkat konversi yang tinggi karena dapat menyebabkan rendemen rendah & waktu lbh lam™

4.    Kemudahan regenerasi enzim